近日，中國海洋大學美獅會李德海教授團隊在國際頂級期刊Chemical Science發(fā)表題為《Multifunctional Cytochrome P450 Orchestrates Radical Cleavage and Non-radical Cyclization in 5-Oxaindolizidine Biosynthesis》的最新研究進展（doi.org/10.1039/D4SC07174C）。該研究通過基因組挖掘、生物合成基因簇的異源表達、底物飼喂、中間體及結構類似物合成，關鍵活性中間體還原性捕獲以及點突變等實驗闡明了具有5-氧雜吲哚里西啶核心化合物penicilactam A（1）的生物合成過程，并發(fā)現了一個新的多功能P450酶PnltC，其通過雙模式催化機制實現分子骨架重構，完成從scalusamide A（2）到1的5-氧雜吲哚里西啶核心骨架構建。

  真菌5-氧雜吲哚里西啶生物堿是一類獨特的雜環(huán)天然產物，根據其核心結構特征，該家族化合物可主要分為兩個主要亞型（圖1）。Penicilactam A（1），首次報道分離自Penicillium brevicompactum，是一種由真菌產生的生物堿類化合物，具有獨特的5-氧雜吲哚里西啶核心結構，并具有潛在的殺蟲活性。然而，該化合物的化學合成產率低、步驟繁瑣，制約了該分子的深入開發(fā)與應用。為解決這一問題，研究人員從橘青霉（Penicillium citrinum）HDN11-186基因組中挖掘負責化合物1生物合成的基因簇pnlt。該基因簇中，雜合型聚酮合酶-非核糖體肽合成酶（PKS-NRPS）首先組裝出N-�；�-D-脯氨酸中間體scalusamide A（2）。隨后，單一細胞色素P450酶PnltC直接催化其轉化為具有5-氧雜吲哚里西啶核心的Penicilactam A（1）（圖1）。

 圖1：已報道分離的5-氧雜吲哚里西啶類天然產物與基因簇pnlt的異源表達

  通過對化學合成的中間體及結構類似物進行底物飼喂、STAB還原捕獲亞胺陽離子實驗，證實了1中5-氧雜吲哚里西啶核心骨架的生成依賴于P450氧化酶PnltC催化的連續(xù)氧化脫羧，且在反應過程中存在亞胺陽離子中間體。隨后，基于推測路徑的DFT計算以及點突變實驗，進一步推測了P450酶PnltC的催化機制（圖2）。其可以催化自由基參與的C?C鍵斷裂，同時利用亞胺陽離子存在時的非自由基親核環(huán)化實現最終骨架的構建。

圖2：推測的兩種PnltC催化機制以及進一步的DFT計算

       此外，同源基因簇的表達研究揭示該類基因簇的強保守性。最后，通過粗酶實驗確定化合物了2中D構型脯氨醇殘基的來源，實現了對化合物1生物合成途徑的完整解析（圖3）。有意思的是，該類結構生成過程中涉及多個活性中間體，可以導致不同的分流產物產生。同時，中間體在不同溶劑中也存在廣泛的自發(fā)反應，因此，對反應過程和產物的準確檢測在研究中至關重要。

圖3：Penicilactam A（1）可能的生物合成路徑

  綜上所述，該研究證明了P450酶PnltC能夠串聯催化自由基氧化與非自由基環(huán)化反應，首先經自由基介導的C?C鍵斷裂生成烯胺中間體，繼而通過非自由基途徑形成亞胺陽離子中間體，最終驅動分子內親核加成反應生成化合物1，這在P450酶中較為罕見。該研究為可持續(xù)獲取1提供了綠色生物合成方法，并拓展了對P450酶催化生成新型天然產物機制的理解。

  中國海洋大學為唯一通訊單位，李德海教授為通訊作者，美獅會博士研究生張開金、碩士研究生孫靜賢為并列第一作者。宋文才、劉峻妤、馬傳騰、陳穎涵、關燕、劉雨婷、任姿霖以及車茜副教授、張國建教授、劉延凱教授、朱天驕教授為文章共同作者。該工作得到國家自然科學基金、青島海洋科技中心科技創(chuàng)新項目、山東省泰山學者青年專家項目、山東省自然科學基金重大基礎研究項目和中央高校基本科研業(yè)務費資助。

  文章鏈接：doi.org/10.1039/D4SC07174C